2023年5月，昆明理工大学谭韬/陈永昌/季维智团队、中国人民解放军总医院刘兵团队及美国德克萨斯州西南医学中心吴军团队合作，在Cell（IF=66.850）发表题为Ex uteromonkey embryogenesis from blastocyst to early organogenesis的文章。该研究开发了一种嵌入式3D培养系统——EMEUC，实现了食蟹猴胚胎体外发育至25 d.p.f.的长时程培养。结合形态学、组织学和单细胞转录组测序分析，系统地解析了原肠运动及造血等早期组织器官发生的谱系特化轨迹和分子演进规律。安诺优达为本研究提供测序服务。

研究背景

在灵长类动物早期胚胎发育过程中，其妊娠第三、四周会经历关键的发育里程碑，最终形成三个主要胚层——外胚层、中胚层和内胚层，并产生各种器官的雏形。在这一时期，发育失败和畸形可导致早孕流产和出生缺陷。因此，对这个神秘“黑盒子”时期胚胎调控机制的探索，对于提高我们对灵长类胚胎发生的认识和理解早期发育障碍的潜在病因至关重要。

研究者开发了嵌入式3D培养系统——EMEUC，通过优化前期食蟹猴胚胎培养系统，借助细胞外基质构建3D培养环境，最终实现食蟹猴胚胎体外25天长时程培养。其形态、发育进程等与体内胚胎高度一致，约对应体内的CS8c阶段。

研究内容

1、单细胞转录组揭示EMEUC胚胎特征

通过对EMEUC培养的食蟹猴胚胎（以下简称EMEUC胚胎）18 d.p.f.至25 d.p.f.的单细胞转录组测序，结合已知谱系的重要Marker基因表达，造血细胞和早期肠细胞两种类群被发现，主要的25种细胞类型被初步注释出来。所有细胞可被分为五大类：内胚层、外胚层、滋养层、中胚层和包括轴中胚层（AM）、EPI、神经板、PGCLC、中内胚层（ PS）和轴旁中胚层（ PM）在内的混合细胞群。 混合细胞群中表达祖细胞的Marker，但不表达完全分化细胞类型的Marker。总之，单细胞转录组测序图谱描绘了原肠胚形成和早期器官发生阶段的食蟹猴体内主要的细胞类型。

图 EMEUC胚胎的单细胞转录组分析

2、EMEUC胚胎的外胚层谱系特化——早期神经外胚层发育

接下来研究者重点关注了EMEUC胚胎早期神经分化情况。首先，经免疫荧光染色进一步验证了不同时期Marker基因表达特征。其次，经过拟时间分析发现EPI分化为NPPs，随后分化为NCPLCs和PPLCs，与体内胚胎一致。再次，细胞通讯分析表明了神经谱系分化过程中，NODAL和WNT信号通路被激活。最后，SCENIC分析确定了NPP、 NCPLCs和PPLCs中的转录因子（TF）调控和网络。总之，EMEUC胚胎重现了早期神经外胚层发育情况，包括转录动力学和空间信号的相互作用。

图 EMEUC胚胎的早期神经发育

3、EMEUC胚胎的中、内胚层谱系特化和卵黄囊的造血发生

EMEUC胚胎同样再现了体内胚胎中胚层谱系的表达特征。AM-like和PM细胞群分别与EPI和PS细胞群密切相关，具有缺乏一些中胚层基因的表达，分化程度较低的特征。与之相反，LPM细胞出现了多种成熟细胞类型。

EMEUC胚胎的造血谱系特化高度模拟了体内卵黄囊的两个波次造血发生，再现了胚胎早期的造血发生。血液中两个造血祖细胞（cluster14.1 HPC1和cluster14.3 HPC2）依次出现，并具有不同的转录组特征。通过和已有文献小鼠和人类的早期造血scRNA-seq数据集的整合分析，HPC1类似于第一波次造血祖细胞。HPC2与HEC共同出现，与第二波次造血祖细胞密切相关。EMEUC胚胎的HEC比人多能干细胞的HEC更类似于体内胚胎HEC。

除中胚层的谱系特化外，EMEUC胚胎也出现了内胚层的特化，内胚层谱系中的DE细胞（cluster21.1 DE1和cluster21.2 DE2）类似于人增殖DE细胞。EMEUC胚胎鉴定出的前肠后肠亚群与体内猴胚胎和人类胚胎具有高度的一致性。进一步研究表明，BMP和EGF信号通路与前肠形成有关，而WNT和Hedgehog信号通路可能在后肠发育中发挥重要作用。

图 EMEUC胚胎的中胚层谱系和造血功能

4、EMEUC胚胎内PGCLC细胞的发育和X染色体剂量补偿调控

原始生殖细胞样细胞（PGCLC）同样会在EMEUC胚胎发生迁移、分化和成熟。EMEUC胚胎内9个不同的PGCLC亚群几乎贯穿了整个发育阶段（18-25 d.p.f.），具有不同的分子特征。在发育过程中，PGCLC细胞开始向卵黄囊迁移，参与氧化磷酸化的基因表达上调，而糖酵解相关基因表达下调，这表明食蟹猴早期生殖细胞发育过程中存在代谢转换。

通过比较各时期不同性别胚胎内外谱系中X染色体基因表达和X:A的剂量平衡，该研究还系统揭示了食蟹猴早期胚胎发育中的X染色体剂量补偿调控过程。雌性PGCLC中X染色体基因表达水平逐渐上调，且存在X染色体再激活过程。参与X染色体失活的 XIST 在雄性早期PGCLCs中很少或没有表达，晚期升高，而在雌性PGCLC中表达水平相对恒定。

研究结论

该研究开发了一种能够支持食蟹猴胚胎体外发育至早期器官发生的3D培养体系，成功将食蟹猴体外的胚胎发育延长到早期器官发生阶段（~25 d.p.f.），并系统研究了非人灵长类从原肠胚形成到早期器官发生过程的重要细胞组成及谱系分化轨迹，这将有助于了解人类胚胎发育畸形和孕早期流产的病因。