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Nature项目文章∣利用10x Genomics单细胞技术研究灵长类胚胎原肠运动至早期器官发育核心事件
2022-12-23 17:47

2022年12月14日,北京干细胞与再生医学研究院/中国科学院动物研究所王红梅和郭帆团队、美国德克萨斯大学西南医学中心吴军团队以及安徽医科大学蒋祥祥团队合作,于Nature在线发表文章"Primate gastrulation and early organogenesis at single-cell resolution"。利用10x Genomics单细胞转录组测序技术,绘制了目前国际上第一张灵长类CS8-11胚胎高通量单细胞转录组图谱,该研究填补了灵长类胚胎原肠运动至早期器官发育阶段的知识空白,并且为人类胚胎模型的研究提供了必要的数据参考。安诺优达为本次研究提供了10x单细胞转录组测序服务。

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研究背景

在人类早期胚胎发育研究中,虽然通过scRNA-seq技术获得了人类胚胎CS7期和CS12-16期以及食蟹猴胚胎CS3-7期的信息,为灵长类动物早期发育研究提供了宝贵的资源,但由于临床诊疗规范限制,人CS8-11的正常胚胎极难获得,因此在此阶段发生的中晚期原肠运动和早期器官发育事件相关研究仍为空白。非人灵长类(如食蟹猴)在进化,生理特征及胚胎发育等多方面与人类高度类似,可作为研究人类早期胚胎发育的良好模型,本文研究者收集了CS8-11阶段食蟹猴胚胎,利用10x单细胞转录组测序技术捕获了56,636个单细胞并进行了生物信息学分析,明确定义了食蟹猴该时期的38个主要细胞类群,绘制了目前国际上第一张灵长类CS8-11胚胎高通量单细胞转录组图谱。


研究思路

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研究结果

1、食蟹猴胚胎CS8-11阶段单细胞转录组图谱构建

研究者收集了CS8-11发育阶段的6个食蟹猴胚胎。将样本分离成单细胞,使用10x Genomics Chromium平台捕获得到56,636个单细胞并用于后续生物信息学分析,每个细胞检测到的中位数为3017个基因。根据已知谱系标记的表达,并与相应发育阶段的小鼠胚胎数据集进行比较,鉴定出38个主要细胞类群,绘制了目前国际上第一张灵长类CS8-11胚胎的高通量单细胞转录组图谱。

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图1 CS8-11期食蟹猴胚胎单细胞转录组图谱构建


2、食蟹猴胚胎中PS及其衍生物的发育轨迹

为了研究食蟹猴原肠运动和早期器官发生过程中的分子和细胞动力学,作者使用了RNA速率分析来预测不同细胞类群的分化轨迹。首先关注了PS形成相关簇,包括PS(簇2)、APS(簇4)、定型内胚层(DE,簇6)、原结(node,簇5)和新生中胚层(Nas.Meso,簇8)集群(图1b)。RNA速率预测了PS/APS在原肠胚形成过程中向DE、Nas.Meso和node分化的三叉轨迹。Nas.Meso产生了大多数的中胚层细胞类型。基于DEG分析,Nas.Meso中间体衍生物,包括中胚层细胞和胚外间充质细胞(EXMCs)(图2e)。


体节发生是由NMP的一种亚型开始的过程。通过IF分析,在CS8胚胎中确定了两个公认的NMP群体:SOX2low/Thigh/TBX6high(促进体节)和SOX2high/Tlow/TBX6low(促进脊髓(SC))(图2d)。

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图2 食蟹猴胚胎中PS及其衍生物的发育轨迹


为了深入了解灵长类动物的肠管(GT)的形成,作者重点研究了DE、脏内胚层(VE)和肠道簇,分析确定了7个前肠、中肠和后肠细胞亚群。通过RNA速率分析,预测:(1)前肠1仅来自DE;(2)后肠2仅由VE贡献,而前肠2、中肠1/2、中肠/后肠和后肠1集群同时包含DE(大部分)和VE细胞。

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拓展图2 食蟹猴肠管的转录组学特征


综上所述,这些分析确定了食蟹猴PS发育、早期中胚层和内胚层分化过程中的主要细胞类型,并阐明了灵长类动物的体节发生和GT形成。


3、食蟹猴胚胎神经细胞的发育图景

在确定胚胎内胚层和中胚层形成后,剩余的NBP向腹侧外胚层(ECT,簇29)分化,形成位于中枢的神经外胚层(NE,也称为神经板)、外围的表面外胚层(SE,簇33和34)和两者之间的神经板边界(NPB),并向腹侧分层分化为神经嵴(NC,簇30),然后神经板变厚、弯曲和褶皱形成神经管,这是中枢神经系统(CNS)的前体。


为了深入了解灵长类动物的神经管发育,研究者再次分析了来自两个CS11胚胎的前脑/中脑/后脑(FB/MB/HB,簇31)和SC(簇32)细胞(图1b)。食蟹猴神经管发育模式为SE在CS8处沿着中外侧轴被指定,然后在CS11处沿着NC分化。此外,随着身体平面图的扩展,中枢神经系统分裂的空间组织沿着A-P和D-V轴进行协调。

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图3 食蟹猴胚胎神经细胞的发育图景


4、早期胚胎器官发生的跨物种转录组学比较

虽然小鼠和食蟹猴是广泛用于理解人类发育的动物模型,但目前还缺乏对小鼠、猴子和人类之间器官发生的早期步骤的单细胞转录组比较。为此,作者首先对小鼠、猴子和人类的模拟物或一对一同源物进行了注释,观察到在原肠运动和早期器官发生过程中同源物的跨物种保守表达模式。研究者将CS8-11猴子胚胎scRNA-seq数据集与来自相应发育阶段(TS9-12)的小鼠胚胎的单细胞转录组进行了整合。UMAP分析显示了来自这两个物种的主要细胞类型匹配良好(图4a)。

小鼠和食蟹猴胚胎之间细胞发育动态存在明显的基因表达模式。热图和IF分析显示,T、EOMES和TBX6等基因在小鼠和食蟹猴的PS,Nas.Meso, NMP和外胚层细胞之间表现出不同的表达模式(图2d和4b)。与小鼠相比,Hippo信号通路的许多下游基因在食蟹猴的NMP和PSM细胞中表达上调(图4c)。溶血磷脂酸(LPA)对Hippo通路的抑制严重损害了小鼠,而对人或猴的PSM分化影响不明显(图4e,f)。总的来说,这些结果揭示了食蟹猴和小鼠之间胚胎发育的保守性和差异性的特征。

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图4 早期胚胎器官发生的跨物种转录组学比较


结论

本研究揭示了灵长类动物原肠运动至早期器官发育阶段胚胎的细胞组分与分子特征、细胞谱系发生过程及分子调控机制。该研究不仅填补了灵长类胚胎原肠运动至早期器官发育阶段的领域知识空白,而且为人类胚胎模型的研究提供了必要的数据参考,为深入了解人类早期胚胎发育过程的调控机理以及发育异常相关疾病的病理奠定坚实基础。


参考文献:Zhai, J., Guo, J., Wan, H. et al. Primate gastrulation and early organogenesis at single-cell resolution[J]. Nature(2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05526-y


关于安诺优达

安诺优达作为单细胞测序技术国内早期服务提供商之一,从传统单细胞测序到10x Genomics高通量单细胞测序;从单细胞转录组学至表观、蛋白质的多组学平台;从常规转录组测序到空间转录组测序,涵盖十大单细胞产品,为您的单细胞科研之路扫平障碍。


撰稿:张雨函 周勋

排版:史婧茹

审核:姜莹