二代16S/18S/ITS测序是通过提取环境样品的DNA，选择合适的通用引物扩增16S/18S/ITS的目标区域，通过高通量测序技术对目标区域进行测序，检测目标区域的序列变异和丰度，以研究环境微生物多样性及群落组成差异。
16S rDNA测序: 16S rDNA为编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，具有10个保守区和9个高变区，保守区反映生物物种间的亲缘关系，高变区反映物种间的差异。对16S rDNA某个高变区进行测序，用于研究环境微生物中的群落结构多样性。
18S rDNA测序: 18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，18S rDNA也包含可变区和保守区。对18S rDNA某个高变区进行测序，用于研究环境微生物中真核微生物的群落多样性。
ITS测序: ITS分为两个区域ITS1和ITS2，ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之间，ITS2位于真核生物 rDNA序列5.8S和28S之间。对ITS1或ITS2进行测序，用于研究环境微生物中真菌群落结构多样性。